Attività ossidante dell’ olio essenziale di limone
e applicazione biotecnologica in Medicina Estetica

1Bertuzzi G., 1Marzola A., 2Angelini P.

1 Master in Medicina Estetica, Facoltà di Medicina e Chirurgia, Università degli Studi di Roma “Tor Vergata”.
2 Dipartimento di Biologia Vegetale e Biotecnologie Agroambientali e Zootecniche, Università degli Studi di Perugina.

INTRODUZIONE

L’invecchiamento della pelle è un evento biologico geneticamente determinato, espressione di un danno intrinseco (chronoaging), dovuto all’età e di un danno estrinseco (photoaging), legato a fattori ambientali che si sovrappone al precedente nelle aree fotoesposte.
L’invecchiamento fotoindotto e ambientale è determinato principalmente dall’esposizione alla radiazione solare, ma non si può trascurare il fumo, l’inquinamento e le sostanze chimiche. Un elemento potenzialmente tossico è l’ossigeno, il quale può dare luogo infatti ai ROS (specie resttive dell’ossigeno) accettando elettroni e creando, quando acquisisce un primo elettrone, un superossido (O2.- ) e acquisendone un altro, un perossido di idrogeno (H2O2) secondo una reazione di dismutazione. In questa reazione si può produrre o un’altra molecola di ossigeno oppure ossigeno singoletto (1O2). Si possono formare anche altri radicali liberi tra cui l’RNS (specie reattive dell’azoto) ed altri di natura lipidica che possono risultare ancora più dannosi per l’organismo in quanto il loro tempo di emivita è più lungo di quelli derivanti dall’ossigeno. Solitamente, i radicali liberi sono intermedi di reazione ad elevato contenuto energetico, estremamente reattivi e a vita breve, ma capaci di esistenza indipendente. Per raggiungere una maggiore stabilità tendono a sottrarre un elettrone (ossidazione) alle specie che li circondano, in reazioni a catena denominate reazioni radicaliche. Esse comprendono inizio (formazione di radicali liberi), propagazione (formazione di nuovi radicali liberi che si ripete spontaneamente) e termine (per accoppiamento con un altro radicale, per dismutazione o per formazione di radicali stabili) (Harman, 1982; Ames, 1992; Kehrer, 1993; Stohs e Bagchi, 1995). Per queste loro proprietà i radicali liberi rappresentano un rischio per l’organismo, perché in grado di reagire potenzialmente con ogni componente cellulare, legandosi a macromolecole quali DNA, lipidi e proteine che vengono a loro volta radicalizzate, con conseguenti gravi alterazioni funzionali. Le principali cellule bersaglio dei radicali liberi sono le cellule endoteliali ed epiteliali, i neuroni e la fibrocellula muscolare, ma anche i monociti, gli eritrociti, i fibroblasti e gli epatociti (Harman, 1981; Halliwell, 1991). Le cellule hanno tuttavia sviluppato una serie di meccanismi di difesa dal danno ossidativo che si basano su sistemi enzimatici (superossido dismutasi, catalasi, glutatione perossidasi) definiti antiossidanti primari, o su scavenger non enzimatici di basso peso molecolare in grado di bloccare i radicali liberi (glutatione, vitamina E, vitamina C, carotenoidi, catechine) definiti antiossidanti secondari. Lo sbilancio tra reazioni ossidanti (in cui sono implicati i ROS ) e meccanismi di difesa è detto stress ossidativo ed è messo in causa per l’insorgenza di tumori, di malattie cronico degenerative, nonché dell’invecchiamento. Il danno radicalico si esprime con una riduzione della biosintesi di proteine, acidi nucleici, fosfo e glicolipidi, componenti delle membrane biologiche. Se mancano i sistemi di difesa i processi riparativi delle componenti della membrana risultano meno efficienti, con alterazione strutturale e perdita di fluidità generando un ciclo di aumentato catabolismo con sempre maggiore alterazione della membrana stessa con un invecchiamento sempre più precoce del tessuto oggetto dell’insulto perossidativo (Halliwell et al., 1992).
La maggior parte delle specie ossidanti vengono generate durante i normali processi fisiologici; fra questi si annoverano i prodotti della respirazione mitocondriale e di reazioni coinvolgenti enzimi quali la lipossigenasi e la xantina ossidasi, così come pro-ossidanti generati dai fagociti del sistema immunitario.  Condizione di stress ossidativi si instaura maggiormente in caso di irraggiamento, fotosensibilizzazione o per cause interne (es.: ischemia) e in queste condizioni è stato dimostrato nella pelle un aumento dei prodotti di per ossidazione ed una deplezione di antiossidanti (Haliwell e Gutteridge, 1989).
La prevenzione dell’invecchiamento e della conseguente invalidità psicofisica costituisce uno dei campi di azione della Medicina Estetica tesa alla costante educazione che  permettere a ciascun individuo una gestione razionale del proprio patrimonio biologico con programmi di igiene mentale, fisica e alimentare. E’, inoltre, una medicina restitutiva e correttiva che utilizza metodologie e tecniche mediche, chirurgiche, fisioterapiche, termali, cosmetiche ed estetiche rigorosamente documentate. Medicina restitutiva che non va intesa nel senso illusorio di "ringiovanimento", poiché ogni età ha il suo aspetto, ma di ripristino delle funzioni fisiologiche turbate dagli stress emotivi, dalla condotta innaturale di vita, dagli inquinamenti ecologici e da malattie vere e proprie.
L’interesse crescente che la Medicina Estetica nutre verso l’ aromaterapia è dovuto ai recenti studi, pubblicati in numerosi articoli, che svelano i meccanismi di azione degli oli e le eventuali controindicazioni (Guba, 2002; Cockayne e Gawk, 1997; Selvagg et al., 1995). La comprensione della funzione della barriera della pelle, via di ingresso degli oli essenziali, e del possibile destino dei componenti degli oli  applicati topicamente ha fornito una guida efficace per un appropriato uso degli oli  nei bambini, negli anziani e nella pelle malata ed è possibile immaginare ulteriori sviluppi incoraggianti.
E’ stato inoltre rilevato che alcuni oli essenziali e loro componenti hanno un effetto citostatico nei confronti di alcune linee di cellule tumorali e quindi sono stati proposti come nuovi agenti antiproliferativi. Dorman et al. (1995) hanno realizzato uno studio sull’attività antiossidante degli oli essenziali di Pelargonium sp., Monarda citriodora var. citriodora, Myristica fragrans, Origanum vulgare ssp. hirtum e Thymus vulgaris effettuando un saggio con acido tiobarbiturico (TBA). Gli oli hanno mostrato una attiva capacità antiossidante a livelli di diluizione molto basse.
Calabrese et al. (1999) hanno isolato dall’estratto di limone una frazione che, applicata sulla pelle, conferisce una notevole resistenza allo stresss ossidativo, inoltre, Mori et al. (2002), hanno rilevato che l’olio essenziale di limone e l’olio di semi di vinaccioli possiedono attività di inibizione dell’elastasi, enzima di degradazione dell’elastina,  proteina che rientra nella struttura fondamentale del derma ed é responsabile di idratazione, tono ed elasticità.
Nel presente lavoro è stata esaminata l’attività antiossidante dell’olio essenziale di limone verso i superossidi, in vitro ed in vivo. Nello studio in vivo, l’olio essenziale di limone è stato utilizzato diluito nell’olio di semi di vinaccioli. L’obiettivo era quello d’individuare una miscela sinergica da utilizzare in modo razionale, come trattamento preventivo dell’invecchiamento della pelle e della formazione di pieghe cutanee, con possibili applicazioni biotecnologiche in dermatologia cosmetica, settore di grande interesse per la Medicina Estetica.

MATERIALI E METODI

Estrazione dell’olio essenziale di limone. Citrus lemon è stato gentilmente concesso da alcuni produttori della regione Sicilia. I limoni, raccolti nel mese di ottobre avevano un colore verde-giallo chiaro e un diametro approsimativamente di 3-3,5 cm. La parte esterna, tagliata con un coltello dal pericarpo del frutto, consisteva del flavedo e parte dell’albedo. Le bucce, approssimativamente 2,6 kg, erano sottoposte a pressione meccanica secondo il metodo descritto da Sawamura e Kuriyama (1988).

Analisi gas-cromatografica

L’olio essenziale di limone è stato analizzato nella sua composizione qualitativa e quantitativa mediante gas cromatografia. Le condizioni di analisi seguite con apparecchio gas-cromatografico Hewlett-Packard 5890 sono le seguenti: detector H-P5970; iniettore Splitt/Splittes; volume iniettato = 1 µl; colonna di carbowax 20 M (lunga 30 cm, con diametro di 0,25 mm); gas di trasporto: elio; flusso: 1 ml/min; temperatura dell’iniettore e del detector: 230 °C; temperatura programmata: 40-220 °C al min, poi isoterma a 220 °C per 10 min.
I diversi costituenti sono stati identificati per confronto “spettro di massa/tempo di ritenzione”, secondo i dati pubblicati in letteratura.
 
Valutazione dell’attività antiossidante.

L’attività antiossidante dell’olio essenziale di limone è stata valutata per il suo effetto sui radicali superossidi generati in vitro mediante il sistema ipoxanthine-xantine ossidasi.
La xantina ossidasi è una delle principali sorgenti enzimatiche che causano la formazione delle specie reattive dell’ossigeno (ROS) in vivo. Sebbene la xantina ossidasi presente nel normale tessuto sia un enzima deidrogenasi che trasferisce elettroni a NAD (nicotinamide-adenina-dinucleotide) ossidando la xantina o l’ipoxantina a acido urico, sotto certe condizioni di stress la deidrogenasi è convertita in un enzima ossidasi mediante ossidazione dei gruppi thiol essenziali o mediante la limitata proteolisi. In seguito a questa conversione l’enzima reagisce sempre come elettron donatore, ma riducendo l’ossigeno invece di NAD, producendo così superossido e perossido di idrogeno e contribuendo all’inizio e alla progressione di numerosi processi patologici (Halliwell e Gutteridge, 1990; Halliwell et al., 1995; Hippeli e Elstner, 1999).
L’attività “scavenging”, nei confronti dei radicali superossidi, di un ampio rango di antiossidanti, è misurata in termini di inibizione della formazione di O2.- con il sistema “ipoxantina-xantina ossidasi (HX-XO)” generante superossidi (Deguchi et al., 2000; Kubo et al., 2000; Lu e Foo, 2000; Calliste et al., 2001; Kweon et al., 2001). Il radicale superossido riduce il nitro-blue tetrazolio (NBT) a formazano e il citocromo C a pH 7,4 a temperatura ambiente; la produzione di formazano è seguita mediante spettrofotometro a 560 nm.

La reazione è stata eseguita secondo Halliwell et al. (1989): 10 µl di olio essenziale di limone (solubilizzato in dimetil solfossido al 10% (v/v) e successivamente diluito con tampone fosfato di potassio 50 mM, pH 7,4 nel rapporto 1:1, 1:100 e 1:1000) è stato aggiunto alla miscela di reazione che conteneva 0,1 ml di 30 mM EDTA, 10 µl di 30 mM hypoxanthine, 100 µl di 3 mM di citocrome c o 3 mM di nitroblue tetrazolium, in un  volume totale di 3 ml. La soluzione è stata portata a volume con 50 mM di tampone fosfato di potassio a pH 7,4. La reazione ha avuto inizio con l’ aggiunta di 0,2 ml di xantina ossidasi diluita al momento nel tampone fosfato pH 7,4 a 1 ml. Il tasso di riduzione del citocromo c o nitroblue tetrazolium erano misurati a 550 e 560 nm rispettivamente a 25 °C. L’attività antiossidante dell’olio essenziale di limone alle varie diluizioni era misurata sulla base della percentuale di inibizione della riduzione del citocromo c o del nitroblue tetrazolium. La concentrazione di citocromo c in soluzione era calcolata misurando l’assorbanza a 550 nm prima e dopo l’aggiunta di un eccesso di ditionito di sodio, usando un coefficiente “molar reduced minus oxidized extinction” di 1,85 x 104 a 550 nm. L’attività della xanthine ossidasi era monitorata in assenza di citocromo c o nitro blue tetrazolio misurando l’assorbanza a 290 nm dovuta a produzione di ureate. Questo saggio è stato incluso per accertare che il composto testato non interferisse con l’attività della xantina ossidasi.
Il controllo è stato effettuato con la vitamina E.
I risultati sono la media± SEM di 6 repliche.

Campionatura di lipidi della superficie della pelle da volontari sani. Lo studio è stato limitato a 45 adulti di sesso maschile. L’età dei soggetti era compresa tra 18-52 anni (media 33 ± 11). Ai soggetti è stato richiesto di evitare l’uso di lozioni per capelli o altri unguenti contenenti oli per tutta la durata dell’esperimento. La procedura sperimentale è stata tesa a valutare l’efficacia dell’olio essenziale di limone nella preventiva perossidazione dei lipidi della superficie della pelle, comparata con l’efficacia della vitamina E. Sulla base dei risultati ottenuti della valutazione dell’attività antiossidante, l’olio essenziale di limone è stato utilizzato diluito in DMSO (dimetil solfossido) e in olio di semi di vinaccioli nel rapporto di 1:100 (per minimizzare eventuali problemi di tossicità). Lo studio è stato condotto presso il “Centro anti-aging A.R.P.A.” di Civita Castellana (VT). I 45 volontari sono stati divisi randomicamente in tre gruppi (A, B e C) di 15 individui ciacuno. Un campione di lipidi della superficie della pelle è stato ottenuto dalla fronte di ciascun individuo come controllo. Al gruppo A è stato chiesto di applicare la vitamina E,  al gruppo B di usare olio essenziale di limone diluito in DMSO e al gruppo C di usare olio essenziale di limone diluito in olio di vinaccioli ( per 7 giorni consecutivi). Ai gruppi sperimentali è stato poi chiesto di lavare la fronte con sapone neutro e al gruppo A è stata data una fiala contenente 3 ml di alfa–tocoferolo solubilizzato in 20% di etanolo da applicare sulla fronte. L’applicazione di vitamina E o olio essenziale era ripetuto ciascun giorno alla stessa ora. 24 ore dopo l’ultimo trattamento, sono stati prelevati campioni di lipidi della pelle mediante la tecnica del tamponamento su un’area della fronte di 3 X 3 cm, con un tampone di cotone. La procedura è stata standardizzata in modo tale che l’area è stata tamponata tre volte orizzontalmente e tre volte verticalmente per ciascun individuo.

Estrazione dei lipidi. Il tampone di cotone utilizzato per il prelievo è stato trattato, per estrarre i lipidi contenuti, con 3 ml di una miscela di cloroformio:metanolo (1:2,5). La procedura di estrazione è stata eseguita per 2 h a temperatura ambiente in presenza di acido eneicosanoico (10 µg) come standard interno. Il cotone è stato di nuovo sottoposto ad estrazione con una soluzione di cloroformio:metanolo  (1ml). All’estratto ottenuto è stato aggiunto l’1% di NaCl in 0,01 M HCl, successivamente è stato centrifugato. Lo strato di cloroformio di entrambe le estrazioni è stato recuperato e sciacquato con 3 ml di metanolo:acqua (1:1). La soluzione è stata centrifugata e dopo la fase di separazione, lo strato di cloroformio è stato recuperato ed evaporato a secco sotto un flusso di gas di N in oscurità. I lipidi secchi sono stati dissolti in 3 ml di una soluzione di cloroformio:etanolo (2:1) e la soluzione è stata immagazzinata a –20 °C in oscurità fino all’analisi del contenuto lipidico.

Stress perossidativo di lipidi della superficie della pelle. La sensibilità dell’estratto dei lipidi della superficie della pelle degli individui dei gruppi sperimentali è stata valutata misurando la suscettibilità dei lipidi allo stress ossidativo in presenza di tert-butil idroperossido (3 mM).

Saggio di Luminescenza. Il danno ossidativo ai lipidi generalmente porta alla formazione di intermediari stabili, grazie al rilassamento di stati elettronicamente eccitati generati da reazioni di radicali liberi: questo comporta un incremento della chemioluminescenza.
Misure di chemioluminescenza sono state realizzate con un luminimetro Turner TD 20/20 luminometro, in accordo al metodo descritto da Flecha et al., (1991).

RISULTATI

L’analisi GC-MS dell’olio essenziale di limone, ottenuto mediante pressione a freddo, ha messo in evidenza la presenza di terpeni, aldeidi, alcoli ed esteri (Tab. 1).
La Tab. 2 mostra l’attività antiossidante ottenuta con l’olio essenziale di limone diluito in DMSO e in olio di vinacciolo. I risultati sono stati riportati come inibizione in percentuale della riduzione di citocromo c o nitroblue tetrazolium in presenza di 10 µl di olio essenziale alle diluizioni di 1: 10, 1:100, 1:1000; alfa-tocoferolo (500 µg), usato come confronto per l’attività antiossidante. Dai dati emerge come l’attività antiossidante dell’olio essenziale di limone sia decisamente superiore a quello della vitamina E (Tab. 2).
La suscettibilità di lipidi allo stress perossidativo è stata valutata usando campioni di lipidi prelevati per lo studio con volontari di sesso maschile. Come evidenziato dalla Fig. 1, i soggetti trattati con olio essenziale di limone alla diluizione 1:100, comparato con i trattamenti con vitamina E, ha minori livelli di chemiluminescenza (tempo 0) ed anche maggiore resistenza a stress perossidativo, come è stato mostrato dai livelli decrescenti di chemioluminescenza dopo incubazione con tert-butyl hydroperoxide (time-point da 1 a 60  min). Questo dimostra che il trattamento con olio essenziale di limone inibisce significativamente i danni perossidativi ai lipidi della pelle. I risultati ottenuti dalla miscela olio essenziale di limone-olio di vinaccioli sono migliori dell’olio essenziale di limone diluito in DMSO (sostanza inerte).

DISCUSSIONI

Nel presente studio abbiamo impiegato dei sistemi perossidativi per imitare le condizioni patologiche ritenute coinvolte nei processi d’invecchiamento della pelle allo scopo di valutare l’efficacia di un antiossidante naturale come l’olio essenziale di limone, capace di  inibire reazioni mediate dai radicali liberi sia in vitro che in vivo. I risultati  del test in vitro sull’inibizione della riduzione di citocromo c o nitroblue tetrazolium ci spingono senz’altro ad affermare che l’olio essenziale di limone ha forti proprietà antiossidanti addirittura superiori alla vitamina E, probabilmente attribuibili al gamma-terpinene, presente nella sua composizione (Suzuki et al., 2004).
Questi risultati sono stati verificati in vivo esponendo i lipidi superficiali della pelle a stress ossidativo, indotto con un sistema perossidativo. In questi casi, dopo l’applicazione topica dell’olio essenziale su volontari sani, i lipidi superficiali della pelle esibivano una significativa maggiore resistenza allo stress ossidativo, come evidenziato dal diminuito livello di chemioluminescenza.
I migliori risultati ottenuti con l’olio essenziale di limone diluito nell’olio di vinaccioli piuttosto che in DMSO sono spiegabili da uno studio realizzato da Ahn et al. (2002) in cui è stato evidenziato che l’olio di vinaccioli è dotato di una forte attività “scavenging” nei confronti dei radicali superossidi, in vitro e in vivo. Grazie a tale attività,  nella miscela, l’olio essenziale di limone e l’olio di vinaccioli producono un effetto di reciproco potenziamento, sicché l’effetto della miscela è superiore a quello delle singole parti.
In conclusione, questo studio indica chiaramente che l’olio essenziale di limone può essere un efficiente strumento farmacologico in grado di controllare i cambiamenti lipoperossidativi a  carico della pelle, mostrando in tal modo l’importanza delle biotecnologie antiossidanti naturali nel trattamento antiaging della pelle.
Rispetto al rimedio fitoterapico, l’olio essenziale ha la prerogativa di essere facilmente assorbito dalla pelle (Bronough et al.,1990), pertanto, oltre alla somministrazione orale, gli oli essenziali hanno un notevole impiego a livello delle applicazioni cutanee (unzioni, massaggi, frizioni, ecc.), utilizzati sempre diluiti in un olio vettore. In merito ai risultati ottenuti in questo lavoro, si consiglia l’applicazione topica dell’olio essenziale di limone diluito nell’olio di semi di vinaccioli nella percentuale dell’1%.

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 (Macrocystis pyrifera) è un prezioso estratto di alghe marine dotato di una specifica attività di inibizione degli enzimi di degradazione di proteine come Collagene e Elastina (detti Collagenasi e Elastasi, in generale Metalloproteinasi o MMP1 e MMP3), struttura fondamentale della pelle e responsabili di idratazione, tono ed elasticità (allo 0.5% riduce l’effetto delle MMP1 e MMP3, dopo l’irradiazione di UVA di circa il 30%; sempre allo 0.5% agisce stimolando la sintesi di Collagene (+23-38%), Elastina (+18-23%),, GAG (+18-23%) e Fibronectina (+16-40%)*).